石正麗新研究:需持續(xù)監(jiān)控蝙蝠 中華菊頭蝠是SARS病毒的宿主

　　中華菊頭蝠ACE2變體對(duì)SARS相關(guān)冠狀病毒感染表現(xiàn)出的不同敏感性

　　為了評(píng)估不同的中華菊頭蝠ACE2分子是否會(huì)影響SARS病毒和蝙蝠SARS相關(guān)冠狀病毒的進(jìn)入，研究者在HeLa細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)了中華菊頭蝠的ACE2的變體，并測(cè)試了攜帶不同刺突蛋白的SARS病毒偽型或蝙蝠SARS相關(guān)冠狀病毒的進(jìn)入效率。

　　4株蝙蝠SARS相關(guān)冠狀病毒按照S1序列可分為4個(gè)基因型。簡(jiǎn)單地說，與SARS病毒的刺突蛋白相比，SARS相關(guān)病毒RsWIV1的RBD與SARS病毒具有氨基酸高度同一性；RsWIV16是SARS病毒的近親，在NTD和RBD均表現(xiàn)氨基酸高相似；Rs4231在NTD上與SARS病毒有著高度的氨基酸相似度；而RsSHC014在NTD和RBD區(qū)域與SARS病毒均有差異。

　　與之前的研究結(jié)果類似：所有四株具有相同基因組背景但不同刺突蛋白的蝙蝠SARS相關(guān)冠狀病毒毒株，都可以利用人類ACE2進(jìn)行相似水平的復(fù)制。

　　然而，它們?cè)谌绾卫�用中華菊頭蝠ACE2方面存在一些差異。所有測(cè)試病毒都能有效利用等位基因1、2、4、5進(jìn)入。具有相同RBD的RsWIV1和RsWIV16則不能使用來自廣東的等位基因6(樣本ID 1434)。具有相同RBD的Rs4231和RsSHC014不能分別使用來自云南和廣東的等位基因7(樣本ID 3357)和等位基因8(樣本ID 1438)。SARS病毒BJ01與WIV1和WIV16的RBD有很高的相似性，能夠在假型感染實(shí)驗(yàn)中使用與Rs4231和RsSHC014相同的蝙蝠ACE2等位基因。

　　這些結(jié)果表明，病毒進(jìn)入細(xì)胞都受到刺突RBD和中華菊頭蝠 ACE2變異體的影響。

　　蝙蝠ACE2殘基突變會(huì)影響其與SARS相關(guān)冠狀病毒RBD的結(jié)合親和力

　　為進(jìn)一步了解SARS病毒和SARS相關(guān)冠狀病毒對(duì)ACE2使用能力不同，研究者表達(dá)了冠狀病毒BJ01、RsWIV1、RsWIV1、RsSHC014的RBD，和3個(gè)中華菊頭蝠的ACE2，分別是等位基因6(樣本1434)，等位基因7(樣本3357)和等位基因2(樣本5720)。

　　隨后，研究者測(cè)試它們之間的親和力。陽(yáng)性對(duì)照為SARS病毒BJ01的RBD 與人ACE2，陰性對(duì)照為SARS病毒RsWIV1的RBD 與人DPP4。實(shí)時(shí)分析表明，基于平衡解離常數(shù)KD，不同RBD與ACE2的結(jié)合親和力不同。

　　與病毒感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn)1434ACE2(等位基因6)與RsSHC014和BJ01結(jié)合，而與RsWIV1的RBD不結(jié)合；研究還發(fā)現(xiàn)3357ACE2(等位基因7)與RsWIV1結(jié)合，但不與RsSHC014和BJ01的RBD結(jié)合；5720ACE2(等位基因2)被發(fā)現(xiàn)能結(jié)合所有測(cè)試的RBD。所有被測(cè)試的RBD都與人類或蝙蝠ACE2具有很高的結(jié)合親和力。然而，與兩種蝙蝠SARS相關(guān)冠狀病毒的RBD相比，它對(duì)中華菊頭蝠ACE2的結(jié)合親和力較低。

　　這些結(jié)果表明，刺突RBD與ACE2的結(jié)合親和力影響病毒的感染能力。

　　SARS相關(guān)冠狀病毒RBDs與中華菊頭蝠ACE2s相互作用的結(jié)構(gòu)模型

　　4個(gè)蝙蝠SARS相關(guān)冠狀病毒的刺突蛋白大小相同，與SARS-CoV的氨基酸同源性超過90%，表明這些蛋白具有228個(gè)相似的結(jié)構(gòu)。在本研究中，他們使用中華菊頭蝠ACE2 3357（等位基因7)構(gòu)建了蝙蝠SARS相關(guān)冠狀病毒RsSHC014 RBD的結(jié)構(gòu)復(fù)雜模型，并用中華菊頭蝠ACE2 1434(等位基因6)構(gòu)建了蝙蝠SARS相關(guān)冠狀病毒RsWIV1 RBD的結(jié)構(gòu)復(fù)雜模型。

　　這與SARS-CoV RBD與人類ACE2的結(jié)合親和實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。與SARS-CoV RBD和人類ACE2界面的接觸殘基相比，可以觀察到ACE2上的兩個(gè)病毒病毒結(jié)合熱點(diǎn)(hotspot hotspot Lys31和Lys353分別由Glu35和Asp38組成的鹽橋)或附近的變化。如前所述，這兩個(gè)熱點(diǎn)隱藏在疏水環(huán)境中。它們?yōu)椴《?受體結(jié)合相互作用提供了大量的能量，并填補(bǔ)了結(jié)合界面上疏水性疊加238相互作用的關(guān)鍵空隙。

　　與人ACE2相比，中華菊頭蝠ACE2-3357的兩個(gè)主要?dú)埩糇兓�是E35K和Y41H。E35K與RsSHC014 RBD中K31和Arg479的鹽橋斷裂，可能影響它們之間的結(jié)合親和力。41位置的組氨酸可能會(huì)削弱K353- d38鹽橋的支撐力，因?yàn)榻M氨酸比酪氨酸的疏水性更弱，導(dǎo)致其與BJ01 RBD的結(jié)合親和力降低。因此，BJ01和RsSHC014 RBD與中華菊頭蝠ACE2 -3357的結(jié)合親和力較低。

　　在中華菊頭蝠ACE2-1434中，位置31發(fā)現(xiàn)了蘇氨酸，這與人類ACE2的這個(gè)位置不同，人類的是賴氨酸。雖然K31T的變化導(dǎo)致其不能與Glu35形成鹽橋，但BJ01的RBD c中的Tyr442可以與之形成氫鍵。但RsWIV1 RBD中位于442的絲氨酸則不具備這種功能。

　　此外，RsSHC014含有一個(gè)位于479的精氨酸，Thr31不能與Glu35形成鹽橋，使Glu35可以與Arg479形成鹽橋，但RsWIV1中的RBD殘基Asn479可能會(huì)導(dǎo)致其失去這一能力。因此，BJ01和RsSHC014 RBD可以與中華菊頭蝠ACE2 -1434結(jié)合，但RsWIV1RBD無法與中華菊頭蝠的ACE2 -1434結(jié)合。

　　本研究中所有的中華菊頭蝠 ACE2在82的位置都包含一個(gè)天冬酰胺，而人類ACE2在此位置則是蛋氨酸。M82N的變化引入了一個(gè)不利的親水殘基，削弱了熱點(diǎn)31周圍的疏水網(wǎng)絡(luò)。此外，Asn82引入了一個(gè)糖基化位點(diǎn)，就像在大鼠ACE2中一樣，導(dǎo)致其不能有效支持SARS-CoV感染；ACE2在82位置上的聚糖可能導(dǎo)致空間干擾病毒RBD結(jié)合。

　　因此，M82N可能對(duì)SARS-CoV及SARS相關(guān)冠狀病毒RBD與中華菊頭蝠ACE2s的相互作用有顯著影響。如前所述，RBD的487殘基與ACE2上的熱點(diǎn)353相互作用。RsWIV1 RBD中含有Asn487, Asn487的極性側(cè)鏈可能與ACE2中Lys353殘基的脂肪族部分發(fā)生不利的相互作用，影響K353與D38的熱點(diǎn)相互作用。

　　此外，RsSHC014 RBD在位置487含有一個(gè)丙氨酸；Ala 487的小側(cè)鏈不支持熱點(diǎn)353的結(jié)構(gòu)。因此，RsWIV1及RsSHC014 RBD與人類ACE2的結(jié)合親和力均低于BJ01，但與人類ACE2的結(jié)合親和力均高于中華菊頭蝠ACE2，這與病毒感染和結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果高度相符。